摘要:目的觀察人參皂苷Rgl對成年大鼠腦缺血后海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響，探討其促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的作用。方法將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、單純?nèi)毖M及人參皂普Rgl治療組。用Longa線栓法制作成年大鼠大腦中動脈閉塞模型。腹腔注射5-}}脫氧尿普(BrdU)標(biāo)記處于增殖狀態(tài)的神經(jīng)干細(xì)胞，用免疫單標(biāo)及雙標(biāo)免疫熒光技術(shù)觀察人參皂普Rgl對局灶性腦缺血后海馬區(qū)BrdU免疫活性及BrdU/Tuj-1和BrdU/Vimentin雙標(biāo)免疫活性的影響，并計數(shù)作定量分析。結(jié)果腦缺血后海馬區(qū)存在BrdU陽性細(xì)胞分布;應(yīng)用人參皂普Rgl后，上述部位及周邊腦區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)及雙標(biāo)陽性細(xì)胞明顯增多((P}0.01)。結(jié)論人參皂普Rgl能誘導(dǎo)海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化，提示其具有促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生的作用。

關(guān)鍵詞:腦缺血 人參皂苷 海馬 干細(xì)胞 細(xì)胞增殖

1.引言

研究發(fā)現(xiàn)，成年哺乳動物腦缺血后，神經(jīng)十細(xì)胞(NSCs)在某些特定區(qū)域如側(cè)腦室下區(qū)(SVZ)和海馬齒狀回顆粒下層(SGZ)的增殖能力有一定程度的提高，并A能分化為一定數(shù)量的神經(jīng)元，但增殖分化的細(xì)胞遠(yuǎn)不能替代腦缺血后造成的大量神經(jīng)元脫失，因此腦缺血成為人類致死、致殘的卞要疾病之一[‘}。人參皂茸Rgl是人參的卞要活性成分之一，對神經(jīng)保護(hù)、增強(qiáng)記憶和抗衰老作用的研究已取得了一定進(jìn)展。但對腦缺血后神經(jīng)發(fā)生的影響研究較少。本研究利用成年大鼠腦缺血模型，觀察人參皂茸Rgl對缺血后大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)NSCs增殖與分化的影響，探討其對神經(jīng)促進(jìn)發(fā)生的作用，為臨床應(yīng)用人參皂茸防治缺血性腦血竹疾病提理論依據(jù)。

2.材料與方法

2.1動物分組及模型制作健康成年Wistar大鼠60只，雌雄不拘，由隴和醫(yī)科大學(xué)遺傳所提供，合格證號:SCXK(京))2002-0006。分設(shè)假手術(shù)組、單純?nèi)毖?缺血)組和人參皂茸Rgl治療(治療)組。每組20只。根據(jù)Longa線栓法制作大鼠右側(cè)局灶性腦缺血模型。術(shù)中常規(guī)檢測肛溫，保持在(37.0士0.5)0C。大鼠術(shù)畢清醒后，觀察其行為變化，按Longa評分標(biāo)準(zhǔn)將大鼠的行為變化分為5級。將1, 2, 3級定為模型成功大鼠，0, 4級棄去。假手術(shù)組:只插線10 mm，不行其他條件十預(yù)。將各組大鼠又分為缺血后1, 3, 7, 14天4個時間點(diǎn)。每個時間點(diǎn)5只大鼠。治療組術(shù)前5天腹腔注射人參皂茸Rgl(20mg/kg) > 2次//d o假手術(shù)組注射相同劑量的生理款水。

2.2主要試劑

人參皂茸Rgl由內(nèi)蒙占康源藥業(yè)有限公司提供(批號:ZZ-5802一內(nèi)衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1999)1787號，規(guī)格:350mg/lOml);一抗為鼠BrdU單克隆抗體及抗兔Tuj-1, Vimentin多克隆抗體;SABC試劑盒、FITC羊抗兔IgG及TRITC兔抗羊IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。2.3 BrdU標(biāo)記的增殖細(xì)胞用胸腺哈陡脫氧核有類似物BrdU標(biāo)記處于增殖狀態(tài)的NSCs。采用脈沖標(biāo)記，各實(shí)驗(yàn)組大uw從處死前24 h開始，腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，每3h 1次，共4次，末次注射后10h處死大鼠。

2.4免疫組織化學(xué)及免疫熒光染色大鼠在麻醉后開胸，經(jīng)升卞動脈插竹，先用生理欲水150 ml快速沖洗，繼而灌注4%多聚甲醛250 ml}灌注完畢后取腦，在40C下將腦移入4%多聚甲醛固定6h，然后移入30%蔗糖液中直到沉底。行冠狀切面冷凍切片，片厚15}tno

2.4.1單標(biāo)免疫組織化學(xué)BrdU檢測首先需要進(jìn)行DNA變性。切片入50%甲酞胺/2XSSC} 650C溫箱2 h} 2 mol/L HCl 370C30min，使DNA變性。經(jīng)0.01 mol/L的TBS漂洗后加入鼠單克隆抗BrdU抗體，40C過夜。采用SABC法染色，切片置入葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳胺溶液顯色，光鏡下胞核呈紫藍(lán)色為陽性結(jié)果。

2.4.2雙標(biāo)免疫熒光染色切片經(jīng)冷內(nèi)酮固定2030 min， 50%甲酞胺/2XSSC} 650C溫箱2 h} 2mo1/L HCl 370C30min， 1%BSA(含0.3%Tri-tonX-100的0.01 mol/L TBS配制)，370C30 min，行雙標(biāo)免疫熒光標(biāo)記，切片分別加兔抗Tuj-1, Vimentin抗體40C孵育過夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記IgG(1:100)370C孵育30 min后，再加一抗鼠單克隆抗BrdU抗體(1:200)4 0C孵育過夜，然后加TRITC標(biāo)記IgG(1:100)370C孵育30 min，日一油緩沖液封固。用Radi-ance 2100TM型激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。

2.5圖像分析

免疫組織化學(xué)BrdU的陽性表達(dá)分別為各自染色條件下結(jié)構(gòu)完整、定位明確、著色較深的細(xì)胞及細(xì)胞核。切片在(X 200)鏡下，隨機(jī)選取10個視野，采用C8真彩圖象分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué)生產(chǎn))對BrdU平均陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行測量分析計數(shù)。熒光雙標(biāo)在每張切片梗死側(cè)截取10個(X 400)視野，計數(shù)平均雙標(biāo)陽性細(xì)胞((BrdU+/Tuj-1+或BrdU+/Vimentin+)數(shù)。

2.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 12.0軟件分析。數(shù)據(jù)計算用Cx士s)表示，兩兩比較用t檢驗(yàn)，P}0.05為差異有顯著性意義。

3.結(jié)果

3.1 BrdU在腦組織的表達(dá)BrdU陽性細(xì)胞著色部位為胞核，成卵圓或橢圓形。免疫組織化學(xué)染色顯示，假乎術(shù)組見極少BrdU表達(dá)，卞要分布于SGZ及SVZ等部位。缺血組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)日明顯增加，在臍眠體、海馬CA1區(qū)、皮質(zhì)及缺血梗死區(qū)周圍等處均有分布。給予人參皂有Rg 1后，BrdU陽性細(xì)胞增多，缺血7天后陽性細(xì)胞達(dá)高峰，以SGZ處最為明顯。在臍眠體呈簇狀分布，而缺血中心區(qū)及缺血邊緣區(qū)呈散落分布。缺血14天可見BrdU陽性細(xì)胞數(shù)日急劇減少，細(xì)胞質(zhì)可有少量表達(dá)(表1)

3.2免疫熒光雙標(biāo)染色激光共聚焦掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)假乎術(shù)組未見雙標(biāo)陽性細(xì)胞。腦缺血14天，雙標(biāo)細(xì)胞卞要位于SGZ區(qū)和臍眠體內(nèi);雙標(biāo)細(xì)胞核中心紅色為BrdU陽性，周邊呈黃色為Tuj-1或Vimentin陽性。BrdU/Vimentin雙標(biāo)細(xì)胞胞核紅色深染，圓形飽滿，突起呈黃色，單個或多個突起不等;BrdU/NSE雙標(biāo)細(xì)胞胞核中心深紅色為BrdU陽性，胞體及突起呈黃色為Tuj-1陽性(圖A^-F)。治療組BrdU/Tuj-1, BrdU/Vimentin陽性細(xì)胞數(shù)分別為(14.3士0.5)個/視野和X15.1士0.5}個/視野，較缺血組(7.2士0.3)個/視野和(8.9士0.4)個/視野明顯增多((P}0.01)

4.討論

免疫組織化學(xué)檢測的BrdU陽性細(xì)胞可代表增殖的神經(jīng)十細(xì)胞[z]。有證據(jù)顯示[3,4]，在成年哺乳動物，SGZ存在NSCs，即在上述部位存在神經(jīng)發(fā)生現(xiàn)象，并目能從SVZ向嗅球遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血后早期階段，SGZ即有BrdU「日性細(xì)胞表達(dá)，缺血7天表達(dá)最為明顯，除海馬結(jié)構(gòu)區(qū)外，在缺血側(cè)大腦半球許多區(qū)域都出現(xiàn)了BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)。在CA1區(qū)及皮質(zhì)也有少量表達(dá)，說明腦缺血后發(fā)生了NSCs的遷移，分化成神經(jīng)細(xì)胞。腦缺血損傷后，nestin, BrdU的重新表達(dá)可能有增強(qiáng)細(xì)胞抗損傷能力、促進(jìn)損傷灶修復(fù)的作用，A能增強(qiáng)腦組織的抗缺血能力，有利于細(xì)胞的存活及缺血損傷后的神經(jīng)再生f51

雖然腦缺血可以引起NSCs增殖，但是這種內(nèi)源性的反應(yīng)遠(yuǎn)不能替代腦卒中等破壞性較大的創(chuàng)傷所造成的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞的脫失。因此，損傷大腦尚不能達(dá)到自我修復(fù)的程度。近年的研究發(fā)現(xiàn)，NSCs的增殖除受細(xì)胞內(nèi)基因的調(diào)控外也可受外源性因素的調(diào)節(jié)，如生長因了}I!神經(jīng)遞質(zhì)等。有研究結(jié)果顯示，堿性成纖維細(xì)胞生長因了、表皮生長因了、抗炎藥物等可能具有促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的作用}}.}sl。如果我們能夠認(rèn)識和控制缺血后神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、成熟、遷移并與i1 :'常細(xì)胞功能性相結(jié)合這一復(fù)雜過程，則對于臨床治療腦缺血損傷及變性疾病均有重要意義[U

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參皂有Rgl能促進(jìn)腦內(nèi)缺血區(qū)BrdU的表達(dá)。從缺血刺激大約1天后BrdU陽性細(xì)胞開始明顯增多，于缺血后7天最為活躍，至14天時N義增殖己明顯減弱。從。與假乎術(shù)組同一部位比較，各時間點(diǎn)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，組間比較有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，人參皂苷有Rgl對腦缺血后BrdU表達(dá)有增強(qiáng)作用，能促進(jìn)NSCs的增殖，同時陽性細(xì)胞表達(dá)范圍增多，說明也能促進(jìn)NSCs的遷移[10}。這在神經(jīng)可塑性和腦損傷后的修復(fù)中可能起著重要作用。本研究雙標(biāo)免疫熒光染色結(jié)果顯示，局灶性腦缺血后14天，缺血側(cè)出現(xiàn)BrdU/Tuj-1, BrdU/Vimentin雙標(biāo)陽性細(xì)胞，治療組雙標(biāo)陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，提示人參皂有Rgl能夠促進(jìn)增殖細(xì)胞分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。上述結(jié)果表明人參皂有Rgl對成年大鼠腦缺血SGZ神經(jīng)十細(xì)胞有促進(jìn)增殖、遷移及分化的作用。但NSCs增殖、遷移及分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等有待于進(jìn)一步研究。